三、高效色谱柱
高效液相色谱使用的液相色谱柱管通常为优质不锈钢制成,内径均匀,色谱抛光,高效无轴向沟槽。液相不锈钢色谱柱可耐压100MPa。色谱常用分析型色谱柱内径为3~4.6mm,高效长度为lOO~250mm。液相内径3mm的色谱柱子也被称为节省溶剂柱。
依色谱柱内径尺寸还有窄径柱(2.1mm)、高效微径柱(1.0mm)之分,液相这类色谱柱适合于液相色谱质谱联用(LC-MS)分析。色谱在建立分析方法时可先考虑使用短柱,高效如果需要特别高的液相分离度,再用长柱。色谱填料粒度通常为3~10μm。5μm粒度色谱柱通常兼顾了柱效、重现性、可靠性和耐用性。3μm粒度色谱柱通常可以实现快速分析,但粒度较细而易堵塞,对过滤要求较高。普通实验室难以制作高效液相色谱柱。
常用商品牌号高效液相色谱仪的色谱柱见。在填料或色谱柱上常会发现一些英文字母,如BDS、RP、CHS、ODS等。一般认为C18是键合了十八烷基碳链的反相固定相的总称。C18柱与ODS(十八烷的英文缩写)柱实际是有区别的,只是由于大部分的C18柱是硅胶载体,因此在很多场合下二者混为一谈。
除了硅胶载体外,还可以包括其他载体的填料,比如高聚物小球、氧化铝、氧化锆、杂化颗粒为载体等键合C18或C8链形成的反相固定相。而ODS则是完全以超纯硅胶为载体键合的C18填料。BDS柱为碱钝化硅胶柱,特别适合于强极性含氮的碱性化合物分离。RP柱是指内嵌了酰胺极性基团的可以在100%的水相条件下对极性化合物有极高保留的C18柱,适用于分离高极性化合物或进行离子对分析;用100%水作流动相时可保持稳定,保证填料寿命长,不塌陷。
CHS柱是指表面带正电荷的杂化颗粒技术制造的色谱柱。据资料介绍,CHS柱只使用0.1%甲酸水溶液,不用离子对试剂就可以进行离子对色谱分析。HSS(highstrengthsilica,HSS)柱是指高强度、耐高压的一类硅胶柱。XP柱通常是指粒径为2.5μm的一类色谱柱,可兼容于高效液相色谱和超高效液相色谱系统的操作。HILIC柱为亲水相互作用色谱柱。这类色谱柱在草甘膦、灭蝇胺等农药的残留分析中已有应用报道。
四、检测器
在液相色谱检测器的发展过程中,先后出现过40多种检测器,目前广泛应用约十几种。
在农药残留分析上应用的主要有紫外可见光检测器(包括光栅型和二极管阵列型)、荧光检测器、电化学检测器、质谱检测器等。
(一)检测器的分类
高效液相色谱仪的检测器按其性质、应用范围、测量原理等可以有多种分类方法。目前一般认为可分为两大类:通用型检测器和专用型检测器。
1、通用型检测器:通用型检测器也称为总体性能检测器。它可连续测量色谱柱流出物(包括流动相和待测物)的全部特性变化,通常采用差分法测量。这类检测器有电导检测器、示差折光检测器等。通用型检测器适用范围广,但由于对流动相有响应,易受温度、流速和流动相组成变化的影响,通常灵敏度低且不宜用于梯度洗脱。
2、专用型检测器:专用型检测器也称为溶质性能检测器。它可测量被分离样品某种组分特性的变化。这类检测器对样品中组分的某种物理性质或化学性质敏感,而流动相不具备这类性质或在操作条件不显示这类性质。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器等。
(二)检测器的性能指标
高效液相色谱使用的检测器对噪声、漂移、灵敏度、检出限、线性范围和响应时间有一些基本的要求,有关知识可参见本章第一节相关内容。表5一15列出了几种常见高效液相色谱检测器的性能。
(三)常用检测器
1、紫外可见光检测器
紫外可见光检测器(U1traviolet—vismledetector,UV—VIS)通称紫外检测器,是液相色谱仪应用最广泛的检测器,为高效液相色谱仪的基本配置,在各种检测器中其使用率高达70%左右,对有紫外吸收的化合物均有响应,既可测190~350nm光谱范围的紫外光吸收变化,又可向350~900nm可见光谱范围延伸。在目前报道的高效液相色谱法测定农药残留分析的文献中,约有90%是采用紫外检测器。
紫外检测器主要有以下特点:灵敏度高,可达0.111满度吸光单位(ahsorhanceunitfullscale,AUFS);噪声低,可降至10-5吸光单位(ahsorbanceunit,AU);对中等强度紫外吸收的农药,检出限可达10-10g,定量限可达10-9g/mL;对流动相组成的变化或温度变化不敏感,适于梯度洗脱;对无紫外吸收的物质无响应或响应很小,容易选用在检测波长下无紫外吸收的流动相,如乙腈、水等;为非破坏性检测器,可用于制备色谱或与其他检测器联用,结构简单,操作方便,便于维修。
(1)工作原理:紫外检测器工作原理基于朗伯一比尔定律。该定律指出,当一束平行单色光辐射通过物质溶液时,如果溶剂不吸收光,则溶液的吸光度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离呈正比,即:
A=I0(1/T)=εbc
式中,A为吸光度,I0为入射光强度,I为透射光度,ε为样品的摩尔吸光系数,b为光程长,c为样品的浓度,T为透射率。
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